■ 분자표지를 이용한 배 검은별무늬병 저항성 개체 조기검정 방법 ■배의 검은별무늬병은 동양배에서는 곰팡이 Venturia nashicola에 의해서 발병되는데, 우리나라 배의 주요 품종인 신고는 감수성이기 때문에 피해가 심각하다. 따라서 농가에서 매년 6회 이상의 약제를 살포함으로써 방제하고 있기 때문에 약제의 다량 살포에 의한 생산비의 증가와 내성균의 출현으로 안정적인 재배가 가능한 저항성 품종의 육성이 시급한 실정이다.DNA 표지에 의한 병 저항성 개체의 검정은 환경 및 발현정도에 영향을 받지 않아 정확한 선발이 가능하다는 장점이 있고, 이를 이용한 저항성 개체의 조기선발은 재식·유지비용과 노동력이 가능하기 때문에 내병성 육종효율을 증진시킬 수 있다. 이에 본 연구는 배의 검은별무늬병 저항성과 연관된 분자표지를 개발하고자 수행하였다. ▲배 검은별무늬병 저항성 연관 분자표지 선발△배 검은별무늬병 저항성 검정=단배×Bartlett 후대의 저항성 계통인 PS2-93-3-98에 감수성인 압리를 교배하여 얻은 79계통의 교배집단을 시험재료로 이용하였다. 접종방법은 Abe와 Kurihara(1992)의 방법을 따랐으며 접종원은 발병된 잎에서 분생포자를 채취하여 사용하였다. 교배실생의 종자를 파종하고 60일 후 본엽이 10내외로 완전히 전개되었을 때 0.1% sucrose와 Tween 80이 첨가된 접종원(1×105 분생포자/mL)을 수관전체에 분무접종하고 접종 후 6주까지 발병정도를 조사하였다.조사방법은 Langford와 Keitt(1942)의 조사기준에 따라 1-10엽위까지의 발병정도를 조사한 후 어떠한 증상이 나타나지 않은 것을 HR(highly resistant), 황색괴사반점만을 형성하는 것을 R(resistant), 일부 엽에 소량의 분생포자를 형성하는 것을 S(susceptible), 여러 엽에 다량의 분생포자를 형성하는 것을 HS(highly susceptible)로 구분하였다.검정 결과는 HR과 R, S, HS의 각 개체수는 32, 8, 11, 28로 저항성과 감수성 개체의 분리비가 40: 39로 이론적 분리비인 1:1에 근접하여 본 실험에 이용된 시험집단에서는 저항성에는 단일우성 유전자가 관여하는 것으로 판단되었다. △BSA(Bulked segregant analysis)-AFLP 분석에 의한 저항성 연관 표지 탐색=AFLP(amplified fragment length polymorphism) 기술은 식물체의 DNA를 제한효소로 처리하여 나타나는 다형성을 PCR을 통해 검출하는 방법으로 한 반응당 얻을 수 있는 표지인자 수가 많은 장점이 있다.또한 AFLP 기술과 BSA와 결합되면 특정형질과 연관된 표지를 찾을 수 있고 특정부분의 포화된 지도를 작성하는데 가장 효과적인 방법으로 간주되고 있다. 따라서 본 실험에서는 병 검정결과를 토대로 하여 HR과 HS로 확인된 각 8개체의 DNA를 동일한 양으로 혼합하여 저항성과 감수성의 DNA bulk를 조제하였고 이를 이용하여 AFLP 분석을 실시하였다. EcoRⅠ+NNN primer와 MseⅠ+NNN primer 480조합을 분석한 결과, 저항성 유전자(Vn)와 연관된 3개의 표지를 최종 선발하였다. 선발된 선발한 3개의 표지인자와 병 저항성 유전자 Vn 과의 유전적 거리를 파악하기 위하여 저항성과 감수성으로 판정된 67개체들을 대상으로 선발표지의 출현여부를 검토하였다. E-ATT/M-CCG293, 328 표지와 Vn 간의 유전적 거리는 2.96 cM이었으며, E-GGT/M-TCT217 표지와 Vn 간의 거리는 0.97 cM 으로서 이들 두 AFLP 표지는 Vn 유전자를 가운데 두고 위치하였다. E-AGT/M-CCA234 표지와 Vn 간의 거리는 6.70 cM으로서 E-GGT/M-TCT217 표지 아래에 위치하고 있었다. 선발한 표지 중에서 E-GGT/M-TCT217 표지가 저항성 유전자와 더 밀접하게 연관되어 있어 저항성 개체의 조기선발 표지로서의 활용성이 높을 것으로 판단된다. ▲선발 DNA 표지인자의 CAPS(Cleaved Amplified Polymorphism Sequence) 표지로의 전환AFLP 표지는 실험방법이 복잡하고 비용이 많이 드는 단점이 있기 때문에 저항성유전자와 밀접히 연관된 E-GGT/M-TCT217 표지를 이용하기 쉽고 재현성 있는 CAPS 표지로 전환하였다.△선발된 DNA 표지의 클로닝 및 염기서열 분석=선발된 DNA 밴드를 agarose gel에서 잘라내어 QIAquick Gel electriction kit를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 pCR2.1-TOPO vector에 ligation 시킨 다음 E. coli TOP10에 형질전환시켜 형질전환된 균주를 선발하였다.이 균주로부터 plasmid DNA를 추출하고 선발된 프라이머를 이용하여 PCR한 후 원하는 표지가 삽입되어 있음을 확인하였다. 염기서열 분석은 자동염기서열분석기를 이용하였다.△특이적인 프라이머 제작·PCR 및 제한효소 처리=선발된 DNA 표지의 염기서열 분석 결과를 토대로 하여 각각 24, 20 base pair 크기의 프라이머 2개를 합성하였다.이 프라이머를 이용하여 PCR 분석 후 XhoI 제한효소를 처리한 결과 저항성친인 PS2-93-3-98과 저항성 F1개체에서만 136bp와 54bp 크기의 밴드가 생성되어 저항성과 감수성 개체의 구별이 가능하였다.▲맺음말내병